Крупномасштабные карты генома

Их составляют по общему принципу: сначала кромсают ДНК на куски, разгоняют получившиеся фрагменты в электрическом поле (электрофорез) и затем гибридизируют с меченым зондом. В результате фрагменты упорядочиваются – воссоздается их исходная последовательность. Для этого используют разные методы поиска перекрывающихся участков.

В любом случае необходимо прежде всего получить фрагменты ДНК картируемого участка в больших количествах. ДНК размножают обычно двумя способами – клонированием и ПЦР.

КЛОНИРОВАНИЕ – по современным понятиям сравнительно примитивный метод. Последовательность действий такова: порезали рестриктазой изучаемый участок ДНК – вставили каждый ее отрезок в молекулу вектора (бактериальной, дрожжевой или другой кольцевой ДНК), разрезанную в одной точке той же рестриктазой: получилась рекомбинантная кольцевая ДНК с "чужой" вставкой. Такую смешанную ДНК "вселяют" в ядро клетки-хозяина (обычно бактерии), и та принимается делиться в культуре, благодаря рекомбинантная ДНК – и.о. ее генома – размножается практически до любого количества копий. Результат – набор клонов разных фрагментов картируемой ДНК, или, как его обычно называют, библиотека клонов.

ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ (ПЦР) – лабораторный синтез фрагментов ДНК без клетки-хозяина. В пробирку к фрагменту, который надо размножить, "подсаживают":

а) фермент ДНК-полимеразу, который осуществляет воспроизведение ДНК в живых клетках;

б) стройматериал, т.е. отдельные нуклеотиды;

в) прамеры – короткие цепочки нуклеотидов, соответствующие концам размножаемого фрагмента. Тут, как видите, слабое место метода: про упомянутый участок надо кое-что знать заранее – а именно структуру праймеров…

Затем пробирку нагревают – фрагмент от жары "расклеивается", разделяясь на две цепи; пробирку охлаждают – праймеры присоединяются к концам фрагмента и полимераза начинает свое дело. Чередуя нагревания и охлаждения, можно за полтора часа довести количество копий нужного участка ДНК до нескольких миллионов – в чем и состоит главное преимущество ПЦР перед клонированием. Но у нее есть два недостатка. Один уже упомянут – нужно знать праймеры "в лицо", иначе реакцию не удастся запустить. Второй – техническая невозможность копировать фрагменты длиннее 5-6 п.н.

После того как все фрагменты ДНК получены в достаточном количестве копий, их упорядочивают, для чего сперва разделяют электрофорезом, а затем химически связывают (гибридизуют) с меченым зондом, чтобы каждый фрагмент встал на свое место и, так сказать, просигналил о себе: вот он я!

Крупномасштабные физические карты генома бывают двух типов. Первый – МАКРОРЕСТРИКЦИОННЫЕ (по принципу "сверху вниз"): ДНК режут редкощепящей рестриктазой на крупные куски, упорядочивают их, потом делят на более мелкие, которые тоже упорядочивают. Такая карта охватывает довольно большие участки генома – до 10 Мб – и не содержит пробелов. Но ее разрешение сравнительно невелико – от 1 Мб до 100 кб.

Гораздо выше точность у КАРТ КОНТИГ. Их строят по обратному принципу – "снизу вверх". Хромосому шинкуют на очень короткие фрагменты, размножают их и упорядочивают. Набор упорядоченных коротких фрагментов, покрывающих определенный участок хромосомы, - это и есть контига. А где сама она расположена на хромосоме, можно установить методом FISH.

Правда, карту контиг трудно расширить до крупных районов хромосомы, поскольку нельзя размножать большие фрагменты ДНК – ни клонированием, ни ПЦР. Хотя в последние годы достигнут серьезный успех: удалось создать гигантскую молекулу-вектор, в которую можно встроить участок человеческой ДНК размером до мегабазы. Этот вектор называется YAC – the yeast artificial chromosome, искусственная дрожжевая хромосома. До внедрения YAC в качестве векторов применялись в основном бактериальные плазмиды – крошечные колечки ДНК, несшие вставки чужеродного материала максимум в 20-40 кб. Смысл применения YAC – значительное уменьшение числа клонов, которые нужно упорядочивать.