Регистрация от целой клетки в условиях плотного контакта

Несмотря на то, что метод пэтч-кламп был разработан для регистрации токов через одиночные каналы, пэтч-пипетки можно с успехом использовать также для регистрации токов от целой клетки (РЦК), особенно когда размеры её невелики. После образования гигаомного контакта мембранный фрагмент под пипеткой можно разрушить, прикладывая к ней короткие импульсы отрицательного давления. Такая манипуляция в большинстве случаев не нарушает контакта пипетки с мембраной, и в результате между пипеткой и содержимым клетки устанавливается хорошо изолированный от омывающего раствора проводящий путь. Такой способ проникновения в клетку наносит ей гораздо меньше повреждений, чем введение стандартного микроэлектрода. Входное сопротивление небольших клеток велико по сравнению с эффективным сопротивлением кончика пипетки, поэтому при работе с ними электрические измерения можно проводить от участка мембраны намного большей площади, чем у исходного фрагмента. В отличие от разных вариантов ПК регистрации этот метод позволяет осуществить регистрацию от мембраны целой клетки, а не от маленького мембранного фрагмента.

Для регистрации на целой клетке пэтч-пипетки заполняют соответствующим раствором с низкой концентрацией ионов кальция. Пипетку прижимают к поверхности клеточной мембраны, в результате чего формируется высокоомный контакт. Затем потенциал пипетки изменяют до отрицательного значения и подают импульсы напряжения с амплитудой в несколько милливольт. На этом этапе производится компенсация быстрой ёмкостной компоненты, обусловленной ёмкостью держателя и стенок пипетки. К пипетке прикладывают импульсы отрицательного давления до тех пор, пока вновь не появятся ёмкостные переходные процессы (возникает дополнительный ток).

Регистрацию от целой клетки можно проводить в течение часа без визуальных или электрических признаков нарушения мембраны. Если исследуемая клетка плотно прикрепилась к культуральной чашке, плавным отведением её от пипетки можно получить конфигурацию outside-out. После такой процедуры клеточная мембрана быстро “зашивается” и клетка является интактной. Но содержимое клетки соответствует раствору в пипетке. Это используется в различных целях:

1. для изменения содержимого выбранной клетки с минимальным повреждением её мембраны.

2. Для проведения исследований с различными внутриклеточными растворами на одной и той же клетке путем смены регистрирующих пипеток.

3. Для регистрации в одном эксперименте интегральных токов и одиночных каналов.

Пипетки должны быть сравнительно широкими и иметь кончики с большим углом схождения.

Между раствором в пипетке и содержимым клетки происходит быстрый обмен, поэтому раствор для заполнения пипеток должен быть близок по своему составу к клеточному содержимому.

Таб. 2. Типичные электрические параметры,

получаемые при регистрации на хромафинных

клетках в конфигурации РЦК

Последовательное сопротивление, Rs

4 МОм

Ёмкость клетки, C

5 пФ

Пост. Времени фиксации потенциала, RsC

20 мкс

Пост. Времени обмена ионов, tоб

Сопротивление клетки, R

10ГОм

Сопротивление утечки, Rут

20ГОм

Шум (среднеквадр. значение, 0-400 Гц)

0,15 пА

Перейти на страницу:
1 2